Методи визначення фосфорилювання та глікозилювання білків

Основними методами ідентифікації фосфорилювання є: a. Аналіз фосфорилювання in vitro: радіометричні кіназні реакції з використанням 32P-гамма-АТФ можна використовувати для виявлення статусу фосфорилювання in vitro; цей метод є напівкількісним, але дозволяє визначити молекулярну масу фосфорильованих білків. b. Радіоактивне імпульсне маркування: для виявлення фосфорилювання in vivo можна використовувати радіоактивне імпульсне маркування; клітини вирощують у присутності 32P-ортофосфату, а потім певний білок імунопреципітують специфічним антитілом. Радіоізотоп, отриманий осадженням, аналізують за допомогою SDS-PAGE електрофорезу та кількісно визначають за допомогою експонування рентгенівської плівки. Цей метод може виявити фосфорилювання за різних фізіологічних умов. в. Антитіла, специфічні для фосфорилювання. Існує дві категорії антитіл, специфічних для фосфорилювання. Перша категорія — це універсальне фосфорильоване тирозин/серин/треонінове антитіло, яке буде зв’язуватися з будь-якою молекулою фосфорильованого тирозину, фосфорильованого серину та фосфорильованого треоніну, незалежно від суміжних амінокислотних залишків; друга категорія антитіл - це антитіла до епітопу амінокислот, специфічні до фосфорилювання. Звичайно, наведені вище методи можна поєднувати з режимом збору даних або після мас-спектрометрії для ідентифікації (передбачуваних) сайтів фосфорилювання, використання універсальних антитіл для сайтів фосфорилювання, щоб визначити, чи цільовий білок фосфорильований у певному типі сайту за допомогою імунопреципітації (IP) .

Аналіз глікозилювання можна виконати шляхом ферментативного розщеплення (наприклад, розщеплення трипсином) білка, що аналізується, з наступним аналізом глікопептидів за допомогою рідинної хромато-мас-спектрометрії (LC-MS) або тандемної мас-спектрометрії з гідрофільною взаємодією (HILIC-MS/ MS), щоб ідентифікувати всі білки зі специфічними молекулами глікану або сайти зв’язування глікану в цільовому білку. Крім того, для деяких глікопептидів мас-спектрометричний (МС) аналіз інтактних білків може надати дані про ідентифікацію видів білка та статус їх глікозилювання, але з нижчою роздільною здатністю.

Підсумовуючи, хоча методи ідентифікації фосфорилювання та глікозилювання білка різні, обидва можна проаналізувати за допомогою мас-спектрометрії, включаючи ідентифікацію фосфорильованих/глікозильованих білків, сайтів модифікації фосфорилювання/глікозилювання та рівнів модифікації. Мас-спектрометрія також стала однією з найпопулярніших технологій дослідження посттрансляційної модифікації завдяки своїй чудовій роздільній здатності, точності та чутливості.